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文献来源
ZhouD,FengH,YangY,etal.hiPSCModelingofLineage-SpecificSmoothMuscleCellDefectsCausedbyTGFBR1ATVariant,anditsTherapeuticImplicationsforLoeys-DietzSyndrome.Circulation,.PMID:
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通讯作者
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摘要
Loeys-Dietz综合征(LDS)是一种易诱发胸主动脉瘤和夹层(TAAD)的遗传性疾病。目前，除了手术切除外，没有其他治疗方法。本研究中，杨博士团队报道了一个带有TAAD的LDS家族病例，该家族成员在TGFBR1基因中存在常染色体显性致病突变(TGFBR1AT)。为了研究这种突变对下游基因功能的影响，该团队构建了正常受试者来源的TGFBR1AT突变的hiPSC，同时还利用CRISPR-Cas9基因编辑技术纠正患者细胞衍生的hiPSCTGFBR1AT突变位点。他们进一步又将这些hiPSC诱导分化为不同谱系的血管平滑肌细胞(SMC)，用以探索不同谱系来源的SMCTGFBR1AT突变带来的功能表型变化。结果发现TGFBR1AT改变了心血管祖细胞来源的SMC(CPC-SMC)的分化动力学和收缩功能，但对神经嵴干细胞来源(NCSC,neuralcreststemcell)的SMC没有影响。单细胞测序技术分析显示突变的SMC具有明显的分化缺陷并导致细胞外基质（ECM）的重构和收缩功能基因的缺失。该研究团队还在机制上揭示了TGFBR1AT如何抑制下游SMAD3和AKT信号的活化。最后，作者使用ActivinA（SMAD3激动剂）和雷帕霉素（AKT激动剂）联合处理CPC-SMC，挽救了AT突变引起的分子和功能缺陷，为TGFBR1突变的LDS患者提供了一种潜在的药物靶点用以预防TAAD。BACKPACK
研究背景
点击查看大图科学问题：虽然LDS的遗传基础已经被很好地理解了，但疾病的分子机制仍不清楚，这也阻碍了治疗策略的发展。此外，不同空间位置的主动脉平滑肌细胞(SMC)的胚胎来源具有异质性，目前尚不清楚致病性的基因突变对SMC功能的谱系特异性影响以及可能导致的LDS表现。逻辑基础：1）TAA的形成与经典转化生长因子-β(TGF-β)信号、细胞外基质(ECM)重构和血管平滑肌收缩相关基因的显性突变有关；2）转化生长因子受体I型和II型(TGFBR1和TGFBR2)突变患者更易患Loeys-Dietz综合征(LDS)；3）鉴于TAA患者主动脉内侧层的细胞和ECM异常，血管SMC已成为了解动脉瘤形成病理生理学的中心焦点；4）不同主动脉区域的血管SMC具有不同的胚胎起源，升主动脉SMC来源于第二心野的神经嵴干细胞(NCSC)和心血管祖细胞(CPC)，主动脉根部SMC主要来源于CPC谱系。BACKPACK
研究思路
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结果解读
1.Loeys-Dietz综合征中TGFBR1AT突变引起CPC-SMC收缩基因表达及功能在临床调查的基础上，同一家族跨越三代的7名家庭成员被诊断为LDS，临床基因检测(结缔组织基因检测)显示，所有诊断为LDS的家族成员都在TGFBR1基因中携带显性致病变异(c.GA)，导致丙氨酸被苏氨酸取代(p.AlaThr)，记为TGFBR1AT。为了明确TGFBR1AT变异如何影响TGFBR1功能，作者构建了LDS的体外疾病模型。作者使用CRISPR-Cas9基因编辑技术体外诱导正常主动脉健康供体细胞(TGFBR1+/+)生成携带c.GA突变的hiPSC，分别得到杂合子(TGFBR1AT/+)和纯合子(TGFBR1AT/AT)克隆。随后，这些hiPSC进一步被诱导分化为不同谱系的SMC，即：CPC-SMC和NCSC-SMC。与对照组CPC-SMC相比，TGFBR1AT/+CPC-SMC表达更低水平的SMC标志物，如ACTA2、CNN1、SM22α和MYOCD。但在NCSC-SMC中并没有检测到这些基因的变化，这表明突变可能导致谱系特异性转录缺陷。接下来，作者检测了突变型CPC-SMC的收缩功能。结果显示，与对照相比，突变型CPC-SMC的收缩性显著降低，而在NCSC-SMC中没有发现明显差异。这些数据表明TGFBR1AT突变以一种针对CPC-SMC的谱系特异性方式损害SMC收缩表型。
点击查看大图2.单细胞测序验证TGFBR1AT突变引起的转录本变化为了阐明TGFBR1AT突变引起的转录变化，作者对三个CPC-SMC细胞群(TGFBR1+/+、TGFBR1AT/+和TGFBR1AT/AT)进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。结果发现SMC收缩标记基因在C2、C6和C7细胞群显著富集，作者将他们命名为SMC1,SMC2和SMC3。同时，作者还发现将近70%的TGFBR1+/+细胞聚集在SMC1、SMC2和SMC3中，而TGFBR1AT/+细胞仅占23%，TGFBR1AT/AT细胞占5%，表明突变细胞中SMC的分布一致性地降低了。此外，细胞周期基因在C4、C5和C8亚群中富集，成纤维细胞标记基因DCN(Decorin)在C1、C3和C8中显著富集，表明大多数TGFBR1AT/AT细胞具有成纤维细胞样特征。基因富集分析(GSEA)显示，在突变的CPC-SMC中，SMC关键生物学过程包括ECM重塑、细胞粘附、胶原纤维形成和SMC迁移的相关基因被下调，而细胞周期基因被上调。基于这些发现，作者随后通过EdU染色验证了突变细胞具有更高的增殖活性。以上结果表明，TGFBR1AT突变改变了SMC转录分子特征，抑制了ECM和收缩基因等的表达。
点击查看大图3.TGFBR1AT突变通过阻断SMAD3和AKT信号通路来影响CPC-SMC收缩性为了进一步验证TGFBR1AT突变在CPC-SMC基因表达和功能中的作用，作者从LSD患者中采集的外周血单个核细胞诱导生成hiPSC(PatientAT/+)，并通过基因编辑校正突变(iWT+/+)。与PatientAT/+相比，iWT+/+CPC-SMC表达更高水平的收缩基因ACTA2、CNN1、SM22α和MYOCD。同时，在凝胶收缩实验中，iWT+/+细胞的收缩功能得到显著改善。以上结果说明，在患者来源的细胞中，纠正TGFBR1AT突变可以显著提高CPC-SMC中收缩基因的表达和功能。为了揭示TGFBR1AT突变引起的下游信号变化，作者检测了TGFBR下游关键效应因子在CPC-SMC和NCSC-SMC中的磷酸化状态。已知TGFBR可通过SMAD依赖和非依赖的通路激活多种下游信号机制，包括MAPK和AKT信号级联。结果发现，相比于TGFBR1+/+CPC-SMC,TGFBR1AT/+和TGFBR1AT/AT，CPC-SMC中的p-SMAD3、p-AKT-T和pAKT-S水平显著降低。此外，与患者的AT/+细胞相比，iWT+/+中这些蛋白的磷酸化水平显著升高。这些结果表明，TGFBR1-SMAD3和TGFBR1-AKT级联蛋白在介导细胞对TGFBR1激活的反应中发挥了关键作用。随后作者进一步证实了CPC-SMC中TGFBR1AT和SMAD3突变引起的转录变化相似。
点击查看大图4.ActivinA和雷帕霉素联合处理可增加TGFBR1ATCPC-SMC的收缩表型基于前面的结果可以得出，SMAD3和AKT是CPC-SMC中TGFBR1信号通路的潜在调节节点（mediators）。此外，突变型CPC-SMC比对照型SMC更容易增殖，从而影响收缩基因的表达。基于这些发现，作者推断突变型SMC收缩基因的表达和功能可以通过激活SMAD3和AKT信号级联而提高。与TGFβ1类似，TGFβ超家族成员ActivinA(ACA)通过SMAD2/3信号级联诱导细胞内信号传导。重要的是，ACA信号通过Activin受体，提供了绕过TGFBR1激活SMAD3的替代策略。根据scRNA-seq数据，Activin受体在对照和突变的CPC-SMC中都大量表达。雷帕霉素是一种广泛使用的AKT激活剂，可不依赖于TGFBR1激活AKT，同时，雷帕霉素还可以抑制SMC的增殖。作者通过联合两者处理突变的CPC-SMC成功地恢复了其收缩基因的表达以及功能。综上所述，ActivinA和雷帕霉素联合处理显著改善了突变体CPC-SMC的收缩性，为改善突变型SMC功能提供了一种药理学策略。
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结论
这项研究揭示了一种致病性TGFBR1突变可导致谱系特异性SMC收缩功能缺陷，揭示了LDS相关主动脉瘤的病因。作为一种潜在的药理学策略，该研究结果强调了ActivinA和雷帕霉素的联合治疗可以挽救突变引起的SMC功能缺陷。
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点评
该研究揭示了一种新的可导致LDS的TGFBR1突变位点，并通过CRISPR/Cas9编辑技术修复突变从而成功恢复突变造成的相关表型改变，为LDS基因治疗可行性提供了支持。此外，作者还发现联合ActivinA和雷帕霉素可以成功绕过TGFBR1突变引起的TGFBR1依赖的信号级联缺失，成功拯救了SMC功能缺陷，为治疗LDS患者提供了潜在临床治疗策略。
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思维发散
1.在CPC-SMC中，作者发现TGFBR1AT突变造成TGFBR1的功能受限，从而抑制下游SMAD3信号通路，导致收缩相关基因ACTA2和SM22a等表达受限，但为什么在NCSC-SMC中却不影响呢？存在其他机制不依赖TGFBR1-SMAD信号从而影响这些基因的表达/功能么？2.雷帕霉素被广泛用于mTOR抑制剂，mTOR信号通路的抑制是否有利于LDS/TAA的进展？注：未经许可请勿转载！英文原文↓↓↓：(