摘要
极早发性精神病（VEOP）是指13岁或13岁以下儿童患有的一种精神疾病。近期，我们对一组患有该疾病的儿童（n=）进行了研究并试图开发一种研究该疾病的多组学方法。
这些患儿均患有一种名为16p13.11染色体微缺失综合征的复发综合征。医学界近期才出现针对此综合征的详细描述，患病者通常具有如下任一或所有特征：发育迟缓、小头畸型、癫痫、身材矮小、面部畸形以及行为问题，还包括精神病症状。我们将名患者登记入组，并获得患者提供的有效微阵列检测结果。我们对患者和家属进行了一次综合征专项调查，以据此阐明医疗领域可能忽视的该病的其他表型和特征。因为阵列无法确定染色体结构变异间隔或复杂染色体重排的确切终点，因此我们重新采集了患者的血液样本，以便在BionanoSaphyr（基因组单分子光学图谱分析系统）上评估此类变异。我们根据多名患有VEOP和16p13.11染色体缺失患者的样本生成了诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的神经元。该染色体区域的杂合性缺失，临床上通常表现为癫痫、头小畸型、发育迟缓以及精神分裂症。为了构建这一疾病的体外模型，我们分别从两名患儿、及其未患病的父母，和第二位患儿的患病的父母身上采集血液样本并分离出成纤维细胞或淋巴母细胞，将成纤维细胞重新编入iPSCs中，并将iPSCs区分为皮质神经元和γ-氨基丁酸能神经元。通过ArrayScanXTI高内涵成像分析系统测定的人源性神经元的形态定量结果显示：与对照组相比，该组样品中的皮质神经元和γ-氨基丁酸能神经元的神经突分支均有增加。同时，在γ-氨基丁酸能神经元中发现mTOR信号中断，原因可能是RRN3表达紊乱。全转录组测序分析显示，细胞粘附和与突触相关的基因家族的表达水平发生了变化；这表明突触形成中可能存在缺陷，原因可能是NTAN1功能紊乱。未来，实验的研究重点是利用CRISPR敲除此染色体区域内受缺失影响的单个基因，以了解每个基因在疾病表型进展中的作用。这些研究将共同帮助医学工作者定义精神疾病背后的分子通路和细胞表型。图1：采集的患者样本患者1（-01）：16p13.11微缺失覆盖3个潜在基因（分析数据来源于微阵列分析报告）
?NTAN1（N末端天门冬酰胺酶）
-将N末端天门冬酰胺转化为天门冬氨酸
-通过特定的E3泛素连接酶，使蛋白质靶向降解为蛋白酶体
由N端规则调控的候选靶向蛋白质：细胞骨架蛋白质MAP2和精神分裂症风险基因RGS4
-Ntan-/-小鼠的精神分裂症样表型：探索性活动减少、条件性回避学习和空间学习缺陷
?PDXDC1（吡哆醛依赖脱羧酶结构域蛋白质1）
-与听力功能丧失有关
-炎性标志物改变相关的SNPs
?RRN3（RNA聚合酶I转录因子）
-用于RNA聚合酶I介导转录起始因子
-通过磷酸化作用，由mTOR进行调控
-RRN3通过p53/细胞应激通路使mTOR信号减弱
-条件型基因敲除小鼠：核仁功能紊乱，p53依赖细胞凋亡
结果
图2：16p13.11:γ-氨基丁酸能神经元和谷氨酸能神经元的神经突分支增加
图为对照组和先证者iPSC的γ-氨基丁酸能神经元典型图像。在ArrayscanXTI上进行的形态分析显示：与对照组神经元相比，在3个先证者样本和3个重复样本中，16p13.11γ-氨基丁酸能神经元上每个神经元的分支点均有增加的趋势。
对照组和先证者iPSC细胞系的γ-氨基丁酸能神经元典型图像。在ArrayscanXTI上进行的形态分析显示：与对照组神经元相比，在3个渊源者样本和3个重复样本中，16p13.11γ-氨基丁酸能神经元上每个神经元的分支点均有增加的趋势。图3a：在病例-01中，与微阵列分析相比，全基因组光学图谱显示出更大、更复杂的染色体缺失间隔。
图3b：在病例-01中，经全基因组光学图谱检测，染色体缺失间隔中存在重叠基因。
图4：16p13.11缺失γ-氨基丁酸能神经元中mTOR信号中断
核仁功能对细胞应激很敏感，并通过p53信号协调减弱mTOR信号；p53信号由RRN3活性受限引发。如果核仁功能因应激而受损，那么，对rRNA转录有很大需求的细胞类型会表现出mTOR信号减弱。通过pS6和p-p70S6K的减少，我们可以证明GABA神经元中的mTOR信号减弱。pS6和p-p70S6K均为TORC1信号下游。
图5：Ampliseq基因表达对比显示受16p13.11缺失影响的新通路
与RNAseq不同，Ampliseq技术将转录组中每个基因的单个扩增子进行放大，提高了基因表达谱对比分析的灵敏度。相比对照组，我们在16p13.11缺失皮质神经元中发现了一个错误调控的原钙粘附蛋白转录因子的基因家族。
qPCR确认命中率图6：16p13.11谷氨酸能神经元显示突触区域有扩大趋势
ArrayscanXTI突触叠加图片展示经Tuj1和Synapsin1染色的皮质神经元的典型图像：
（粉色Syn1点，蓝色代表神经突）。三个先证者样本中有两个样本显示：与对照组相比，在Syn1和PSD95区域，每个神经突的长度均有增加。复制正在进行。
结论及未来研究方向
Exomes+CMA（对基因组反应）作为一种卓有成效的方法，通常用于发现与VEOP相关的新基因和间隔。
我们从患者及其一级亲属的样本生成iPSCs。
3名患有16p13.11缺失患者的iPSC衍生神经元显示：神经元形态存在缺陷，mTOR信号减弱，皮质神经元原钙粘蛋白的表达水平发生变化，并且突触区域可能出现变化。
BionanoOGM数据显示：一些16p13.11间隔可能很复杂；该数据还提供了临床阵列分析结果中遗漏的其他详情和信息。
未来的研究将探索16p13.11缺失的功能后果，以及神经轴突和突触区形态变化的分子机制。
作者
CatherineA.Brownstein1*,ElizabethD.Buttermore2*,MargaretHojlo1,3,IvyPin-FangChen2,NickeshaAnderson2,KristinCabral1,CasieGenetti1,JosephGonzalez-Heydrich3
1TheMolecularGeneticsCoreFacilityandtheMantonCenterforOrphanDiseaseResearch,DivisionofGeneticsandGenomics,BostonChildren’sHospital,BostonMA;2TranslationalNeuroscienceCenter,BostonChildren’sHospital,BostonMA;3DepartmentofPsychiatry,DevelopmentalNeuropsychiatryResearchProgram,BostonChildren’sHospital,BostonMA.*表示共同第一作者，与第一作者对本文作出同等贡献。参考文献
BrownsteinCA,etal..Am.J.Med.Genet.A.A(5):5-,UllmanR,etal..Hum.Mutat.28:-.,TropeanoM,etal..PLoSONE8:e.致谢
Dr.Hyman,TheBroadInstitute,TommyFussFamilyFoundation,MantonCenterforOrphanDiseaseResearch,HMSDICP往期回顾
◆BionanoGenomics学术研讨会总结回放：OGM全基因组光学图谱技术联盟盛会关于Bionano
Bionano是一家生命科学仪器公司，服务于基因组分析领域。Bionano开发并销售Saphyr系统——一个超灵敏和超特异性结构变异检测平台，帮助研究人员和临床医生快速找到新的诊断和治疗靶点，并建立和开发比传统细胞遗传学技术更系统、更精简和更工业化的数字细胞遗传学检测手段。Saphyr系统包括仪器、芯片耗材、试剂和一套数据分析工具。关于SaphyrSaphyr系统以kbp-Mbp级别读长可实现超高灵敏度的结构变异检测分析和复杂基因组denovo组装。在结构变异检测领域目前广泛应用于肿瘤、白血病、遗传病、罕见病等疾病的研究。相比传统的结构变异检测工具，如核型、FISH，Saphyr拥有无可比拟的分辨率、全基因组覆盖度，便捷的操作流程以及直观的结果呈现，对结构变异领域的难点平衡易位和倒位，可准确检出。在基因组denovo组装领域，Saphyr帮助生物学家极大提高scaffold，提升组装质量和完整性。Saphyr半导体芯片上有多达,个纳米通道，经高清CCD对所有纳米通道的DNA实时成像，每个flowcell可采集高达5T数据，软件自动将图片数据转换成分子数据，最终组装得到全基因组光学图谱。